Ligation-During-Amplification
Ligation-During-Amplification (LDA) ist eine molekularbiologische Methode zur linearen Amplifikation von zirkulärer DNA (zum Beispiel einem Plasmid) in einem PCR-basierten Verfahren. Dabei werden ein oder mehrere sequenzspezifische Primerpaare mit den einzuführenden Sequenzveränderungen, eine thermostabile DNA-Polymerase sowie eine thermostabile DNA-Ligase verwendet.[1][2][3] Diese Methode wird auch als QuikChange Multi von Stratagene vermarktet.[4]
Diese Methode wird genutzt zur gezielten Mutagenese von Plasmiden im Zuge einer gewünschten Anpassung des Vektors oder der Expressionskassette im Zuge des Proteindesigns. Dabei wird mit einem mutagenen Primer ein Strang der zirkulären Plasmid-DNA (Template) in einem Thermocycler in mehreren Zyklen linear amplifiziert und ligiert. Anschließend wird die parentale, methylierte Plasmid-DNA (Template) mit dem Restriktionsenzym DpnI, welches nur dam methylierte DNA spaltet, abgebaut. Danach wird die amplifizierte, mutierte, einzelsträngige, zirkuläre DNA in Bakterien transformiert und dort zur doppelsträngigen Plasmid-DNA vervollständigt.
Eine weitere Methode basiert auf der Umkehrung des Prinzips. Hierzu wird zur Amplifikation Hydroxymethyl-Desoxycytidin (HMdCTP) anstelle des dCTPs gegeben und anschließend mit einer Mischung aus den Restriktionsendonukleasen ApeK1 und Pho1 in einem Aktivitätsverhältnis von 2:1 restringiert. Dadurch wird nur die DNA-Vorlage (ohne Hydroxymethyl-Desoxycytidine) zerlegt. Die Ligation erfolgt nach der Transformation in vivo.
Literatur Bearbeiten
- ↑ Z. Chen, D. E. Ruffner: Amplification of closed circular DNA in vitro. In: Nucleic Acids Res, Band 26, 1998, S. 1126–1127, PMID 9461478, PMC 147341 (freier Volltext)
- ↑ A. R. Shenoy, S. S. Visweswariah: Site-directed mutagenesis using a single mutagenic oligonucleotide and DpnI digestion of template DNA. In: Anal. Biochem. Band 319, 2003, S. 335–336. PMID 12871732 doi:10.1016/S0003-2697(03)00286-0
- ↑ A. Sawano, A. Miyawaki: Directed evolution of green fluorescent protein by a new versatile PCR strategy for site-directed and semi-random mutagenesis. In: Nucleic Acids Res, Band 28, 2000, S. E78. PMID 10931937, PMC 108465 (freier Volltext)
- ↑ QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit. Manual (Memento vom 23. Mai 2006 im Internet Archive; PDF)
Weblinks Bearbeiten
- The Primer Generator (Memento vom 22. Januar 2009 im Internet Archive) – Automated generator of primers for site-directed mutagenesis
- PrimerX – Automated design of mutagenic primers for site-directed mutagenesis