Label-Transfer
Ein Label-Transfer (engl. label ‚Markierung‘) beschreibt die Quervernetzung von interagierenden Proteinen oder Proteinuntereinheiten mit einem signaltragenden und spaltbaren Vernetzer.[1][2]
Eigenschaften Bearbeiten
Wenn zwei Proteine oder zwei Untereinheiten eines Proteins aneinanderbinden, kann diese Interaktion durch kovalente Verknüpfung dieser beiden Teile fixiert werden.[3]
Bei einem Label-Transfer werden Vernetzer mit zwei unterschiedlichen reaktiven Gruppen (heterobifunktionelle Vernetzer) verwendet, die gleichzeitig ein messbares Signal und eine selektiv spaltbare Bindung tragen.[4] Als Signale werden meistens Biotin, ein Fluorophor oder ein Radionuklid verwendet. Selektiv spaltbare Bindungen sind z. B. Disulfid-Verbindungen oder Ether.[5] Das Protein, für das Interaktionspartner gesucht werden, wird als bait-Protein (engl. für ‚Köder‘) bezeichnet, das bindende Protein als prey-Protein (engl. für ‚Beute‘).
Das bait-Protein wird zuerst mit dem Vernetzer gekoppelt. Heterobifunktionelle Vernetzer werden verwendet, damit die Kopplung durch unterschiedliche Reaktionsbedingungen steuerbar wird und nach der Markierung des bait-Proteins eine Kopplung der zweiten Vernetzungsfunktion erst nach Zusammenbringung mit dem prey-Protein erfolgt. Dadurch wird eine Reaktion beider reaktiven Gruppen des Vernetzers mit dem bait-Protein (Selbstvernetzung, nicht Nachbarvernetzung) gemindert. Nach Zugabe des prey-Proteins wird durch eine Veränderung der Umgebungsbedingungen (z. B. pH-Wert, ultraviolettes Licht) die zweite reaktive Gruppe des Vernetzers reaktiv und bindet statistisch an Moleküle in der unmittelbaren Umgebung des bait-Proteins. Durch die Bindung beider Proteine aneinander ist die zweite reaktive Gruppe in unmittelbarer Umgebung des prey-Proteins und reagiert mit diesem bevorzugt. Da das im Vernetzer enthaltene Signal zwischen der spaltbaren Stelle und der zweiten reaktiven Gruppe am prey-Proteins liegt, wird nach einer Vernetzung und anschließenden Spaltung des Vernetzers das Signal vom ursprünglich markierten bait-Protein auf das prey-Protein übertragen. Da die Vernetzung durch die Spaltung aufgehoben wurde, kann mit geeigneten Methoden das markierte prey-Protein charakterisiert werden, z. B. per Western Blot, per Massenspektrometrie oder durch einen Edman-Abbau.
Literatur Bearbeiten
- Friedrich Lottspeich, Joachim W. Engels, Solodkoff Zettlmeier Lay: Bioanalytik. Spektrum, Heidelberg, 3. Auflage 2012, ISBN 978-3827400413.
Einzelnachweise Bearbeiten
- ↑ D. A. Fancy: Elucidation of protein-protein interactions using chemical cross-linking or label transfer techniques. In: Current Opinion in Chemical Biology. Band 4, Nummer 1, Februar 2000, S. 28–33, PMID 10679368.
- ↑ S. S. Andrews, Z. B. Hill, B. G. Perera, D. J. Maly: Label transfer reagents to probe p38 MAPK binding partners. In: ChemBioChem Band 14, Nummer 2, Januar 2013, S. 209–216, doi:10.1002/cbic.201200673. PMID 23319368. PMC 3762675 (freier Volltext).
- ↑ B. Liu, C. T. Archer, L. Burdine, T. G. Gillette, T. Kodadek: Label transfer chemistry for the characterization of protein-protein interactions. In: Journal of the American Chemical Society. Band 129, Nummer 41, Oktober 2007, S. 12348–12349, doi:10.1021/ja072904r. PMID 17894490. PMC 2529226 (freier Volltext).
- ↑ J. B. Denny, Günter Blobel: 125I-labeled crosslinking reagent that is hydrophilic, photoactivatable, and cleavable through an azo linkage. In: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Band 81, Nummer 17, September 1984, S. 5286–5290, PMID 6433347. PMC 391688 (freier Volltext).
- ↑ C. L. Jaffe, H. Lis, N. Sharon: New clevable photoreactive heterobifunctional cross-linking reagents for studying membrane organization. In: Biochemistry. Band 19, Nummer 19, September 1980, S. 4423–4429, PMID 7190840.